Caracterização bioquímica e funcional da lipase/esterase lesA secretada por Xanthomonas axonopodis pv. citri na doença do cancro cítrico

LesA, from the citrus canker pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), is an α/β hydrolase fold protein with lipase/esterase function encoded by the gene XAC0501. In silico analysis revealed that LesA gene encodes a lipase/esterase orthologous to the LipA enzyme, which is present in several species of Xanthomonas. In this study, we aimed to biochemically characterize LesA, and to determine the importance of this protein in the virulence of Xac. A LesA mutant was generated, and lipase and esterase activities showed that it was significantly diminished in the lesA mutant compared with wild-type str. 306 (Xac306wt). If LesA is partially responsible for citrus canker symptoms, there should be spatial association of LesA with the leaf symptom. As a demonstration of the ability of LesA to induce symptoms, ΔXac-LesA and Xac306wt cells were pressure-infiltrated into citrus leaves. The mutants were able to induce local necrosis, but not as much as the Xac306wt. The ΔXac-LesA mutants may be deficient in pathogenesis due to the lack of LesA. Furthermore, with the aim of confirming the importance of the LesA protein on the virulence of Xac, we proceeded with a secretome analysis in planta (citrus leaf infected with Xac306wt) as well as under three different in vitro growth conditions. For the cultivation of bacteria, we used a virulence noninductive medium, NB, and two virulence-inductive media XAM1 and XAM1-Ex (XAM1 plus 30% of citrus leaf extract). Unfortunately, we could not identify the presence of the lipase/esterase LesA from the secretomes. The secretome analysis presented here offers, nonetheless, new insights into the pathobiology of this pathogen. This secretome enabled us to identify a series of putative virulence factors that might play important roles in the development of citrus canker. We proceeded with the biochemical characterization of Xac306wt grown under different in vitro conditions. Results showed that the lipase activity was higher in the cells grown under virulence-inductive medium than the non-inductive medium. Nevertheless, the esterase activity did not demonstrate the same result. We performed the recombinant expression of LesA protein in E. coli cells. The results confirmed the lipase/esterase activity of this enzyme. In addition, LesA was able to activate a hypersensitive response in Nicotiana tabacum. In conclusion, we propose that LesA may play an important role in the virulence of Xac.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoDissertação (Mestrado)A proteína LesA é uma enzima do tipo α/β hidrolase codificada pelo gene XAC0501 em Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), agente causador do cancro cítrico. Análises in silico revelaram que o gene lesA codifica uma lipase/esterase ortóloga à enzima LipA, presente em diversas espécies do grupo das Xanthomonas. Este estudo teve como objetivo realizar a caracterização bioquímica da proteína LesA e determinar a sua importância na virulência de Xac. Para isso, mutantes de Xac para o gene lesA (ΔXac-LesA), foram obtidos e submetidos a caracterização de sua atividade lipásica e esterásica, onde apresentou significante redução em comparação com a cepa selvagem Xac str. 306 (Xac306wt). Com a finalidade de se constatar a importância da LesA na virulência e patogenicidade do microrganismo em estudo, folhas de citros foram inoculadas com ΔXac-LesA e Xac306wt. Os resultados demonstram que os mutantes foram capazes de causar danos teciduais, porém, em menor escala que a Xac306wt, possivelmente devido a ausência da atividade de LesA. Provavelmente, esta deficiência na patogênese de ΔXac-LesA pode ter sido causado pela ausência da expressão da LesA. Em seguida, se procedeu com as análises dos secretomas in planta (folhas de citros infectada com Xac306wt) e das três condições de meio de cultivo diferentes (meio que não induz a virulência, NB, e dois meios indutores de virulência XAM1 e XAM1-Ex), afim de identificar a LesA. Infelizmente, não constatamos a presença da LesA nos secretomas, contudo os dados encontrados oferecem novos insights sobre como ocorre a patogênese deste microrganismo e permitiu a identificação de uma série de fatores de virulência que podem ser importantes no desenvolvimento da doença. Posteriormente, se procedeu com a caracterização bioquímica das colônias de Xac306wt sob diferentes condições de cultivo in vitro, e observamos que a atividade lipásica foi maior nas colônias cultivadas em XAM1 e XAM1-Ex do que em NB. No entanto, a atividade esterásica não demonstrou o mesmo resultado. A partir da expressão de proteína LesA em E. coli DH5a, se confirmou a atividade de lipase/esterase desta enzima que provou ser capaz de ativar uma resposta de hipersensibilidade em Nicotiana tabacum. Em conclusão, propomos que LesA desempenha um papel importante na virulência do patógeno Xac, oferecendo novos insights sobre a patogênese deste microrganismo

Identification and analysis of seven effector protein families with different adaptive and evolutionary histories in plant-associated members of the Xanthomonadaceae.

The Xanthomonadaceae family consists of species of non-pathogenic and pathogenic γ-proteobacteria that infect different hosts, including humans and plants. In this study, we performed a comparative analysis using 69 fully sequenced genomes belonging to this family, with a focus on identifying proteins enriched in phytopathogens that could explain the lifestyle and the ability to infect plants. Using a computational approach, we identified seven phytopathogen-enriched protein families putatively secreted by type II secretory system: PheA (CM-sec), LipA/LesA, VirK, and four families involved in N-glycan degradation, NixE, NixF, NixL, and FucA1. In silico and phylogenetic analyses of these protein families revealed they all have orthologs in other phytopathogenic or symbiotic bacteria, and are involved in the modulation and evasion of the immune system. As a proof of concept, we performed a biochemical characterization of LipA from Xac306 and verified that the mutant strain lost most of its lipase and esterase activities and displayed reduced virulence in citrus. Since this study includes closely related organisms with distinct lifestyles and highlights proteins directly related to adaptation inside plant tissues, novel approaches might use these proteins as biotechnological targets for disease control, and contribute to our understanding of the coevolution of plant-associated bacteria

Genetic parameters and selection indices in the development of soybean genotypes targeting agronomic traits and resistance to Sclerotinia sclerotiorum

The soybean [Glycine max (L.) Merrill] is the most important crop cultivated in Brazil, and is one of the most relevant commodities of the international agricultural trade. Currently, Brazil is the world’s top producer followed by the United States and Argentina. The brazilian rise in soybean cultivation is intrinsically linked to the success in studies related to the area of soybean genetic improvement. The main objective of any breeding program is to identify, among the segregating populations, the few genotypes with the best genetic combinations, including grain quality, grain yield, adaptation and disease resistance. In this regard, an efficient estimation of genetic parameters such as variance components, heritability and selection gain can result in a more efficient selection process to obtain promising genotypes from segregating populations. One of the main factors that can limit the worldwide soybean production is the occurrence of diseases. Soybean white mold (WM), caused by Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, is considered the one of most destructive disease affecting soybean crops. Currently, there are no cultivars genetically resistant to S. sclerotiorum available. However, several studies have demonstrated that individual cultivars can differ in susceptibility, thus representing a key element for breeding programs. Genetic resistance is one of the main alternatives in the control of plant diseases, because in addition to being more economically viable, compared to the use of fungicides, it is easy to use, less aggressive to the environment, to the farmer and to the consumer. Therefore, to effectively develop soybean genotypes resistant to white mold and with superior agronomic traits, it is necessary to be cautious in the selection of parents. In addition, soybean breeding also targets a set of characters related to morpho agronomic traits that give the genotypes high grain yield, adaptability and stability. This thesis is divided into three chapters. Chapter I presents the literature review, which discusses the current situation in soybean breeding, genetics resistance to WM and production. In chapter II, the aim of the study was to develop soybean genotypes with resistance to white mold, while maintaining other desirable agronomic traits. And in chapter III, the objective was to estimate genetic parameters and analyze selection strategies in the development of soybean genotypes, in the F3 and F4 progenies, to identify the genotypes that present superior agronomic characters, such as in production and early cycle, and specifically in F4, to identify genotypes with resistance to the fungus Sclerotinia sclerotiorum.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorCNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoFAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas GeraisUFU - Universidade Federal de UberlândiaTese (Doutorado)A soja [Glycine max (L.) Merrill] é a cultura agrícola brasileira com maior crescimento nos últimos anos, e está entre as espécies vegetais mais importantes e rentáveis no mundo. O Brasil é o maior produtor de soja do mundo, seguido por Estados Unidos e Argentina. A ascensão brasileira no cultivo de soja está intrinsicamente ligada ao sucesso nos estudos relacionados à área de melhoramento genético de soja. O objetivo dos programas de melhoramento, de um modo geral, é o desenvolvimento de novas cultivares mais produtivas, com resistência às doenças de maior dano econômico, mais estáveis e melhor adaptadas às diferentes condições de cultivo. A este respeito, Estimativas dos parâmetros genéticos, tais como os componentes de variância, herdabilidade e ganho de seleção, juntamente com os índices de seleção, auxiliam em um processo de seleção mais eficiente em obter genótipos promissores durante o desenvolvimento de novos genótipos. Os problemas fitossanitários são os principais fatores que limitam a obtenção de altos níveis de produção de grãos de soja. O fungo Sclerotinia sclerotiorum, causador da podridão branca da haste da soja, também conhecida como mofo branco, é uma das mais antigas doenças da soja. É importante salientar que, no momento, a principal forma de controle do mofo branco é a prevenção e que não há disponibilidade de cultivares de soja totalmente resistentes a ele. Porém, vários estudos demonstraram que há diferenças de suscetibilidade entre as cultivares de soja frente a infecção por este patógeno. A resistência genética é uma das principais alternativas no controle de doenças de plantas, pois além de ser mais viável economicamente, se comparado ao uso de fungicidas, é de fácil utilização, menos agressiva ao meio ambiente, ao agricultor e ao consumidor. Portanto, para desenvolver, de maneira eficaz, linhagens de soja resistentes ao mofo branco e com características agronômicas superiores, é necessário ter cautela na seleção dos parentais. Além de resistência às doenças, no melhoramento da soja também são almejados um conjunto de caracteres relacionados aos caracteres morfoagronômicos que conferem às linhagens elevada produtividade de grãos, adaptabilidade e estabilidade. A presente dissertação está dividida em três capítulos, sendo o capítulo I uma revisão bibliográfica sobre a cultura da soja, a doença mofo branco, a identificação de genótipos resistentes à doença e o melhoramento genético da soja; no capítulo II, o objetivo foi desenvolver linhagens de soja com resistência ao mofo branco, mantendo outros caracteres agronômicos desejáveis; e no capítulo III, o objetivo foi estimar parâmetros genéticos e analisar estratégias de seleção no desenvolvimento de genótipos de soja, nas progênies F3 e F4, para identificar os genótipos que apresentam caracteres agronômicos superiores, tais como em produção e ciclo precoce e, especificamente na F4, identificar os genótipos com resistência ao fungo Sclerotinia sclerotiorum

Identification and analysis of seven effector protein families with different adaptive and evolutionary histories in plant-associated members of the Xanthomonadaceae.

The Xanthomonadaceae family consists of species of non-pathogenic and pathogenic γ-proteobacteria that infect different hosts, including humans and plants. In this study, we performed a comparative analysis using 69 fully sequenced genomes belonging to this family, with a focus on identifying proteins enriched in phytopathogens that could explain the lifestyle and the ability to infect plants. Using a computational approach, we identified seven phytopathogen-enriched protein families putatively secreted by type II secretory system: PheA (CM-sec), LipA/LesA, VirK, and four families involved in N-glycan degradation, NixE, NixF, NixL, and FucA1. In silico and phylogenetic analyses of these protein families revealed they all have orthologs in other phytopathogenic or symbiotic bacteria, and are involved in the modulation and evasion of the immune system. As a proof of concept, we performed a biochemical characterization of LipA from Xac306 and verified that the mutant strain lost most of its lipase and esterase activities and displayed reduced virulence in citrus. Since this study includes closely related organisms with distinct lifestyles and highlights proteins directly related to adaptation inside plant tissues, novel approaches might use these proteins as biotechnological targets for disease control, and contribute to our understanding of the coevolution of plant-associated bacteria